3 นักวิจัย คณะวิทยาศาสตร์ ม.มหิดล เผยเบื้องหลังเรื่องราวการพัฒนาชุดตรวจ COVID-19 ฝีมือคนไทย ด้วยเทคโนโลยี CRISPR Diagnostic แบบเจาะลึก

สถานการณ์การระบาดของ COVID-19 ก็คงดำเนินไปอย่างต่อเนื่อง ยอดผู้ป่วยโดยรวมทั่วโลกเพิ่มขึ้น หลายประเทศทั่วโลกขาดแคลนอุปกรณ์ทางการแพทย์ต่าง ๆ แต่ท่ามกลางวิกฤติ ก็มีนวัตกรรมการผลิตอุปกรณ์ทางการแพทย์เกิดขึ้นเช่นกัน เมื่อไม่นานมานี้มีการเผยว่าทีมนักวิจัยไทยสามารถผลิตชุดตรวจ COVID-19 ต้นแบบได้สำเร็จ โดยความร่วมมือของผู้เชี่ยวชาญหลายสถาบัน ซึ่งมี 3 นักวิจัย ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ดนยา ปโกฏิประภา ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.รัชนก ตินิกุล และ ดร.สิทธินันท์ ชนะรัตน์ อาจารย์ประจำภาควิชาชีวเคมี จากคณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล ในฐานะภาคีเครือข่ายร่วมทีมวิจัยพัฒนาชุดตรวจ COVID-19 กับคณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล สถาบันวิทยสิริเมธี (VISTEC) โดยความช่วยเหลือด้านเทคโนโลยีจากสถาบัน Broad Institute, Massachusetts Institute of Technology and Harvard, USA  รวมถึงผู้เชี่ยวชาญของสถาบันชั้นนำของประเทศ ได้แก่ กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข โรงพยาบาลพระปกเกล้า จังหวัดจันทบุรี ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย และ คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย โดยการสนับสนุนงบประมาณการวิจัยจากกลุ่ม ปตท. และธนาคารไทยพาณิชย์ (SCB)

Test Test Test หนทางการรับมือการแพร่ระบาดใหญ่ครั้งใหญ่

ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ดนยา ปโกฏิประภา กล่าวว่า จากข้อมูลปัจจุบัน ผู้ติดเชื้อ COVID-19 ร้อยละ 80 มีอาการแสดงน้อย และอาจไม่รู้ตัวว่าป่วยเป็น COVID-19  นอกจากนี้พบว่าสามารถตรวจพบเชื้อได้ก่อนผู้ป่วยจะเริ่มแสดงอาการถึง 1-3 วัน ซึ่งผู้ติดเชื้อกลุ่มนี้แม้จะยังไม่รู้ตัวว่าป่วย แต่ก็สามารถแพร่เชื้อให้ผู้อื่นได้ และหากผู้ที่ได้รับเชื้ออยู่ในกลุ่มเสี่ยง เช่น มีโรคประจำตัว หรือเป็นผู้สูงอายุ เมื่อติดเชื้อแล้วอาจมีอาการรุนแรงได้ นอกจากนี้ยังมีผู้ติดเชื้ออีกจำนวนหนึ่ง ซึ่งอาจสูงถึงร้อยละ 18 – 20 ที่ไม่มีอาการแสดงเลย ในปัจจุบันยังไม่มีข้อมูลแน่ชัดว่าผู้ติดเชื้อกลุ่มนี้สามารถแพร่เชื้อให้ผู้อื่นได้หรือไม่ ดังนั้นการตรวจหาเชื้อจึงเป็นกุญแจสำคัญในการควบคุมโรค การตรวจทำให้ทราบว่าใครติดเชื้อบ้าง นำไปสู่การกักตัวและรักษาไม่ให้เชื้อแพร่ไปสู่ผู้อื่นได้ การตรวจโรคเมื่อเกิดการแพร่ระบาดครั้งใหญ่จะนำมาซึ่งข้อมูลเชิงสถิติและระบาดวิทยา ช่วยให้เรารู้ขอบเขตของการระบาด วางแผนการควบคุมโรคที่จะเป็นประโยชน์ในการจัดการเชิงนโยบายของภาครัฐเพื่อควบคุมการระบาดของโรค ลดการแพร่เชื้อและควบคุมจำนวนผู้ป่วยไม่ให้เพิ่มขึ้นจนเกินความสามารถของระบบสาธารณสุขในการรองรับผู้ป่วยได้นั่นเอง

Sensitivity (ความไว) และ Specificity (ความจำเพาะ) ของชุดตรวจกับสถานการณ์การระบาดในวงกว้าง

เมื่อกล่าวถึงชุดตรวจโรค จะมีคำศัพท์ที่ได้ยินบ่อย ๆ 2 คำ คือ ความไว (Sensitivity) หมายถึง ความสามารถในการตรวจจับตัวอย่างมีเชื้อ หรือมีผลเป็นบวก ส่วนความจำเพาะ (Specificity) คือ ความสามารถในการแยกแยะตัวอย่างที่มีเชื้อออกจากตัวอย่างที่ไม่มีเชื้อ หรือมีผลเป็นลบ ตามอุดมคติแล้ว ย่อมอยากจะให้ชุดตรวจมีทั้งความไวและความจำเพาะที่สูงทั้งคู่เพื่อความแม่นยำสูงสุด เพราะหากชุดตรวจมีความไวต่ำก็จะทำให้ตรวจไม่พบเชื้อทั้งที่ผู้ป่วยติดเชื้อ หรือที่เรียกว่าผลลบปลอม (False negative) กลับกันหากชุดตรวจมีจำเพาะต่ำก็จะให้ผลตรวจว่าติดเชื้อทั้งที่ไม่ได้ติดเชื้อเรียกว่าผลบวกปลอม (False positive) แต่การพัฒนาชุดตรวจให้มีครบทั้งความไวและความจำเพาะที่สูงเป็นเรื่องที่ต้องใช้เวลา ในสถานการณ์การระบาดที่เป็นไปอย่างรวดเร็วเป็นวงกว้าง ซึ่งต้องการควบคุมโรคที่มีประสิทธิภาพ โดยเร่งตรวจหาผู้ติดเชื้อให้ได้มากและเร็วที่สุด หากมีผู้มาตรวจ COVID-19 ที่โรงพยาบาลและมีผลตรวจว่าไม่พบเชื้อทั้งที่ติดเชื้ออยู่ แล้วกลับไปแพร่เชื้อให้กับผู้ที่อยู่ใกล้ชิดย่อมส่งผลให้ควบคุมการระบาดได้ยาก ดังนั้นในกรณีนี้ชุดตรวจจึงควรมีความไวมากกว่า โดยยังคงความจำเพาะเอาไว้ตามมาตรฐาน

กว่าจะมาเป็นชุดตรวจ COVID-19

การพัฒนาชุดตรวจ COVID-19 มีสิ่งที่ต้องรู้อย่างน้อย 3 เรื่อง คือ หนึ่งต้องรู้จักไวรัส เช่น รูปร่างลักษณะ ชนิดของสารพันธุกรรม ลำดับของเบสบนสารพันธุกรรม และพฤติกรรมการก่อโรคของไวรัส เช่น อวัยวะหรือสารคัดหลั่งที่สามารถพบไวรัสได้มากในร่างกายของผู้ติดเชื้อ ซึ่งมีรายงานการวิจัยของนักวิทยาศาสตร์ทั่วโลกตลอด 2-3 เดือนที่ผ่านมา

สิ่งที่ต้องรู้อย่างที่สองคือ ต้องรู้ระบบตรวจไวรัส (Detection) ซึ่งทีมวิจัยเลือกใช้ระบบ CRISPR-Cas ที่มีหลักการทำงานจากภูมิคุ้มกันวิทยาทางแบคทีเรีย มาใช้ช่วยในการตรวจไวรัส

และสุดท้าย ต้องรู้เทคโนโลยีการผลิตโปรตีนและเอนไซม์ ให้จำเพาะกับสารพันธุกรรมของไวรัส เพื่อออกแบบไกด์อาร์เอ็นเอ (guide RNA, gRNA) สำหรับช่วยในการตรวจหาสารพันธุกรรมของไวรัส ซึ่งตรงนี้เป็นจุดแข็งของกลุ่มวิจัยและพันธมิตร ดร.สิทธินันท์ ชนะรัตน์ เผย

รู้จัก CRISPR Diagnostic และการทำงานของ SHERLOCK นักสืบ RNA หัวใจสำคัญของชุดตรวจ CRISPR

CRISPR Diagnostic หรือชุดตรวจคริสเพอร์ คือชุดตรวจที่ใช้คริสเพอร์แคสเทคโนโลยี (CRISPR-Cas Technology) ซึ่งมีต้นแบบมาจากกลไกป้องกันตัวเองของแบคทีเรียจากการถูกไวรัสของแบคทีเรีย (Bacteriophage) โจมตี ด้วยการจดจำรหัสพันธุกรรมไวรัสของแบคทีเรียที่เคยเข้ามาในเซลล์บนยีนที่เรียกว่า CRISPR แล้วสร้างโปรตีน Cas ไปตัดโมเลกุลสารพันธุกรรมของไวรัสแบคทีเรียให้เสียหาย ทำให้ไวรัสไม่สามารถทำงานได้

CRISPR-Cas Technology ถูกใช้งานอย่างแพร่หลายในการแก้ไขลำดับเบสในสารพันธุกรรม (Genome editing) โดยเฉพาะโปรตีน Cas9 ทั้งนี้โปรตีน Cas มีอยู่หลายชนิด และแต่ละชนิดนั้นก็มีคุณสมบัติและการทำงานต่างกัน บางชนิดมีความจำเพาะ (Specificity) ในการตัดโมเลกุลของสารพันธุกรรมเทียบเท่าหรือมากกว่า Cas9 อีกด้วย

สำหรับโปรตีน Cas ที่นิยมใช้ในการพัฒนาชุดตรวจโรค คือ Cas12 และ Cas13 ซึ่งมีคุณสมบัติไม่เหมือนโปรตีน Cas ตัวอื่น ด้วยคุณสมบัติที่เรียกว่า Collateral activity ที่เมื่อโปรตีน  Cas พบลำดับเบสเป้าหมายบนสารพันธุกรรมและตัดโมเลกุลของสารพันธุกรรมแล้ว ก็จะสามารถตัดโมเลกุลกรดนิวคลิอิกอื่น ๆ ที่อยู่ข้างเคียงอย่างไม่จำเพาะด้วย คุณสมบัตินี้มีประโยชน์อย่างยิ่งในการใช้ขยายสัญญาณในชุดตรวจโรค ด้วยเหตุนี้ทีมวิจัยจึงเลือกใช้เทคนิค SHERLOCK ที่คิดค้นโดยทีมของ Dr. Feng Zhang จาก Broad Institute, Massachusetts Institute of Technology and Harvard ที่มี Cas13 ซึ่งมีความจำเพาะในการตัดโมเลกุลสารพันธุกรรมที่เป็น RNA และทำหน้าที่ช่วยขยายสัญญาณ มาพัฒนาเป็นชุดตรวจ COVID-19

ขั้นตอนการทำงานของชุดตรวจ แบ่งออกเป็น 2 ขั้นตอนหลัก ขั้นแรกเป็นการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมด้วยเทคนิค Isothermal amplification โดยสกัดเอาสารพันธุกรรม RNA มาจากตัวอย่างของผู้ป่วยในรูปของสารละลายและนำมาเปลี่ยนเป็น DNA ด้วยวิธี Reverse Transcription (RT) และเพิ่มจำนวนให้มีปริมาณมาก ด้วยวิธี Recombinase-Polymerase Amplification (RPA) แล้วจึงทำการเปลี่ยนกลับเป็น RNA อีกครั้งเพื่อให้เหมาะสมสำหรับการทำงานของ Cas13 ด้วยโดยการเติม T7 RNA Polymerase ลงไป จากนั้นขั้นตอนที่ 2 เป็นขั้นตอนของการตรวจวัด (Detection) โดยอาศัยการทำงานของเอนไซม์ Cas13 และ guide RNA โดย guide RNA จะนำทาง Cas13 ไปยังตำแหน่งที่ตรงกับลำดับเบสในสารพันธุกรรมของไวรัสเพื่อทำการตัดตรงตำแหน่งดังกล่าว และตัดโมเลกุลกรดนิวคลิอิกที่ทำหน้าที่เป็น Reporter ส่งผลให้โมเลกุลของสารฟลูออเรสเซนซ์ (Fluorescence) ที่ทำหน้าที่เปล่งแสงเป็นตัวส่งสัญญาณ แยกออกจากโมเลกุลของตัวดูดแสง หรือ เควนเชอร์ (Quencher) ทำให้ตัวส่งสัญญาณเปล่งแสงให้สัญญาณได้

นอกจากจะอ่านผลจากการเปล่งแสงของตัวส่งสัญญาณด้วยเครื่องวัดแสงแล้ว ทีมวิจัยยังออกแบบชุดตรวจเป็นแบบแท่ง (Lateral flow strip) ที่ลักษณะการใช้งานคล้ายชุดตรวจการตั้งครรภ์ ที่สามารถอ่านผลจากแถบสีที่ปรากฏ เพื่อให้ง่ายต่อการใช้งานภาคสนามมากขึ้นโดยใช้โมเลกุลของ FAM ที่จับกับ Biotin เป็นตัวส่งสัญญาณ ชุดตรวจแบบแท่งนี้มีองค์ประกอบสำคัญ 3 อย่าง คือ ปลายแผ่นกระดาษที่มีอนุภาคนาโนของทองคำที่มี Antibody จำเพาะต่อ FAM แถบที่มีโมเลกุลของ Streptavidin ซึ่งมีคุณสมบัติในการจับกับ Biotin อย่างแน่นหนา และแถบของโปรตีนที่จำเพาะกับ Antibody ต่อ FAM

โดยขั้นตอนการทำงานของชุดตรวจแตกต่างกันเล็กน้อยคือ หลังจากเติม Cas13 และ guide RNA ลงในสารละลายตัวอย่าง Cas13 ตัดสารพันธุกรรมของไวรัสและตัดโมเลกุลของ FAM ที่จับกับ Biotin ที่ทำหน้าเป็นตัวส่งสัญญาณแล้วนำแท่งตรวจจุ่มลงไป เมื่อสารละลายซึมผ่านปลายกระดาษ FAM จะจับกับอนุภาคนาโนของทองคำที่มี Antibody จำเพาะต่อ FAM และแพร่ต่อไปยังจุดที่มีโมเลกุลของ Streptavidin ซึ่งจะจับกับ Biotin ในสารละลายปรากฏเป็นแถบที่ 1 บนกระดาษ เหลือเพียงอนุภาคนาโนของทองที่จับกับ FAM แพร่ต่อไปยังจุดที่มีโปรตีนจำเพาะกับ Antibody ต่อ FAM และจับกันปรากฏเป็นแถบที่ 2 อ่านผลได้ว่าพบเชื้อไวรัสหรือมีผลเป็นบวก 

ทั้งนี้ หากโมเลกุลของ FAM ไม่ถูก Cas13 ตัดออกจาก Biotin ทั้งหมดจะถูกจับอยู่กับ Streptavidin ทำให้ชุดตรวจจะมีแถบสีดำปรากฏขึ้นเพียง 1 แถบเท่านั้น ซึ่งสามารถอ่านผลได้ว่าไม่พบเชื้อไวรัสหรือมีผลเป็นลบ ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ดนยา ปโกฏิประภา อธิบาย

3 จุดเด่นของชุดตรวจ COVID-19 CRISPR

เมื่อเทียบกับ RT-PCR ซึ่งเป็นวิธีการมาตรฐาน หรือ Gold standard test ที่ WHO แนะนำสำหรับการตรวจ COVID-19 แล้ว ชุดตรวจที่ทีมวิจัยร่วมคิดค้นขึ้นมีจุดเด่น 3 ประการด้วยกัน คือ ใช้เวลาตรวจน้อยกว่า ใช้เครื่องมือวิทยาศาสตร์ที่ไม่ซับซ้อน และมีราคาต่อหน่วยถูกกว่า

กล่าวคือ Real time RT-PCR ปกติจะใช้เวลาประมาณ 3  ชั่วโมง แต่การตรวจเชื้อด้วยชุดตรวจ CRISPR นี้ใช้เวลาเพียง 1 ชั่วโมง นอกจากนี้เนื่องจากระหว่างกระบวนการ PCR จะต้องเปลี่ยนอุณหภูมิให้สูง-ต่ำ ถึง 3 ช่วงอุณหภูมิในการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมของเชื้อเพื่อให้สามารถตรวจจับสัญญาณได้ นั่นหมายถึงต้องอาศัยเครื่อง Real time thermo cycler ที่มีราคานับแสนบาท ส่วนการตรวจด้วย CRISPR นั้นสามารถใช้เครื่องควบคุมอุณหภูมิอย่างง่ายได้ เพราะใช้อุณหภูมิเดียว ที่อุณหภูมิ 39-42 องศาเซลเซียสในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม

ที่สำคัญ เมื่อรวมค่าสารเคมีสำหรับการทำ RT-PCR แล้วจะมีต้นทุนการตรวจต่อ 1 ตัวอย่าง ราคาไม่ต่ำกว่า 1,000 บาท

ในขณะที่ชุดตรวจ CRISPR นั้นมีต้นทุนการตรวจอยู่ที่ประมาณ 700 บาท ต่อ 1 ตัวอย่าง ทั้งนี้ราคานี้เป็นราคาที่คำนวณจากการใช้เอนไซม์และสารเคมีที่นำเข้าจากต่างประเทศ ซึ่งหากใช้เอนไซม์และสารเคมีที่ผลิตเองในประเทศ ราคาต้นทุนต่อการตรวจก็จะสามารถลดต้นทุนในการตรวจลงไปได้อีก ดร.สิทธินันท์ ชนะรัตน์ ให้ข้อมูล

และแม้ว่าชุดตรวจ CRISPR จะมีจุดเด่นทั้ง 3 ข้อ และเหมาะกับใช้ตรวจคัดกรองในจุดที่มีผู้ป่วยอยู่ (Point of care) เพื่อความสะดวกและรวดเร็ว ก็ไม่ได้หมายความว่าจะนำมาใช้แทน Real time RT-PCR ที่เป็นวิธีการมาตรฐานในปัจจุบัน  แต่สามารถนำมาช่วยเสริมประสิทธิภาพการคัดกรองเพื่อป้องกันโรคได้ดียิ่งขึ้น ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ดนยา ปโกฏิประภา กล่าวเสริม

จากห้องปฏิบัติการสู่การใช้จริง

เมื่อไม่นานมานี้ได้มีการนำชุดตรวจไปทดสอบทางคลินิกกับตัวอย่างที่โรงพยาบาลศิริราช ซึ่ง ศาสตราจารย์ ดร. นพ.ประสิทธิ์ วัฒนาภา คณบดีคณะแพทยศาสตร์ศิริราชพยาบาล ออกมาเผยว่าได้ผลดีเป็นที่น่าพอใจทีเดียว หลังการเสร็จสิ้นการทดสอบทางคลินิกแล้วก็จะต้องผ่านขั้นตอนการรับรองมาตรฐานก่อนที่จะแจกจ่ายให้กับโรงพยาบาลต่าง ๆ ต่อไป

มองไปข้างหน้า พัฒนาต่อยอดลดความเสี่ยง พร้อมเสริมศักยภาพการแข่งขันในเวทีโลก

ในอนาคตอันใกล้นี้ทีมวิจัยวางแผนจะผลิตส่วนประกอบสำหรับชุดตรวจเองทั้งหมด โดยขณะนี้สามารถผลิต Cas13 และ guide RNA ได้เองแล้ว และจะขยายผลการผลิตให้สามารถผลิตเอนไซม์รวมถึงสารเคมีอื่น ๆ ให้ได้ด้วยเช่นกัน เพื่อลดต้นทุนการผลิตและลดความเสี่ยงในกรณีที่ไม่สามารถนำเข้าสารเคมีได้ นอกจากนั้นรูปแบบการทำงานของชุดตรวจที่พัฒนาขึ้นด้วยเทคโนโลยี  CRISPR-Cas นี้ ยังสามารถนำไปต่อยอดในการตรวจความผิดปกติทางพันธุกรรมของโรคบางโรค การตรวจเชื้อ เช่น ตรวจเชื้อก่อโรคที่ปนเปื้อนในอาหาร ช่วยเสริมศักยภาพและเพิ่มขีดความสามารถแข่งขันของประเทศไทยบนเวทีโลกได้อีกด้วย ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.รัชนก ตินิกุล กล่าวในตอนท้าย

สัมภาษณ์และเขียนข่าวโดย : นางสาวปัณณพร แซ่แพ
นักประชาสัมพันธ์ งานสื่อสารองค์กร คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล

ตรวจสอบโดย : ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.ดนยา ปโกฏิประภา
ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.รัชนก ตินิกุล
ดร.สิทธินันท์ ชนะรัตน์

เว็บมาสเตอร์: นางอริศรา รักษ์ดำรงธรรม