เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส |
การศึกษาเอนไซม์ในกลุ่มที่มีฟลาวินเป็นองค์ประกอบ
โครงสร้างของ FMN
เอนไซม์ในกลุ่มนี้ใช้อนุพันธ์ของวิตามินบีสอง
ซึ่งอยู่ในรูปของฟลาวินอะดีนีนไดนิวคลีโอไทล์
(flavin adenine dinucleotide; FAD)
และฟลาวินโมโนนิวคลีโอไทล์ (flavin
mononucleotide; FMN) เป็นโคแฟกเตอร์
(ตัวช่วยในการทำปฏิกิริยา) เอนไซม์
กลุ่มนี้มีบทบาทที่สำคัญในการเร่งปฏิกิริยาการให้และรับอิเล็กตรอน
ในปฏิกิริยาเคมีของสิ่งมีชีวิต
เราได้คัดเลือกเอนไซม์กลุ่มนี้
มาศึกษากลไกการทำงาน 3 ตัว คือ เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส
(p-Hydroxyphenylacetate hydroxylase;
HPAH) เอนไซม์ไพราโนสออกซิเดส (Pyranose
oxidase) และ เอนไซม์ลูซิเฟอเรส (Bacterial
luciferase)
เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส
จากเชื้อแบคทีเรีย Acinetobacter
baumannii
เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส
(p-Hydroxyphenylacetate hydroxylase;
HPAH) เป็นเอนไซม์ ในกลุ่มฟลาโวโปรตีนโมโนออกซีจีเนส
(Flavoprotein monooxygenase) โดยถูกคัดแยกมาจากจากเชื้อแบคทีเรีย
Acinetobacter baumannii เอนไซม์นี้ทำหน้าที่เติมหมู่ไฮดรอกซีให้กับสารตั้งต้น
นำมาซึ่งสารผลิตภัณฑ์ที่สลายตัวได้ง่ายขึ้น
หรือสารที่ละลาย น้ำได้ดีขื้น และจะเป็นประโยชน์อย่างมากในการย่อยสลายสารเคมีตกค้าง
ที่เป็นพิษต่อสิ่งแวดล้อม จากการศึกษาพบว่าเอนไซม์นี้
ประกอบด้วยเอนไซม์สองส่วนที่ไม่ได้ยึดติดกัน
ส่วนแรกคือ เอนไซม์รีดักเทส (Reductase
component; C1) ที่ใช้ FMN เป็นโคแฟกเตอร์
ซึ่งทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนจาก
Nicotinamide adenine dinucleotide
(reduced form; NADH) เพื่อผลิตรีดิวซ์ฟลาวิน
(FMNH-) ให้กับส่วนที่สอง คือ เอนไซม์ออกซีจีเนส
(Oxygenase component; C2) โดยจะทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาเติมหมู่ไฮดรอกซี
(Hydroxylation หรือ Monooxygenation)
ให้กับสารตั้งต้น คือ พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตท
(p-hydroxyphenylacetate;
HPA) (Eur J. Biochem 268, 5550-61)
ในปฏิกิริยาที่ไม่มีเอนไซม์ C2 เอนไซม์
C1 สามารถเร่งปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนจาก
NADH ได้สารผลิตภัณฑ์เป็นไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ในปัจจุบัน เราได้ทำการโคลนและแสดงออกของยีน
โดยใช้แบคทีเรีย E. coli เพื่อให้ได้เอนไซม์ในปริมาณที่มากพอสำหรับศึกษาวิจัย
(Biochim Biophys Acta 1680 (1), 60-6)
ในระยะ
10 ปีที่ผ่านมา ได้มีรายงานการวิจัยเกี่ยวกับเอนไซม์โมโนออกซีจีเนส
ที่ประกอบด้วยเอนไซม์สองส่วนที่คล้ายๆ
กับเอนไซม์ C1 และ C2 ซึ่งเอนไซม์กลุ่มนี้จะเกี่ยวข้องกับการย่อยสลายสารเคมีสังเคราะห
์หรือสารพิษที่ตกค้างอยู่ในธรรมชาติ
อีกทั้งยังเกี่ยวข้องกับกระบวนการสร้างสารยับยั้งจุลินทรีย์อีกด้วย
เนื่องจากรีดิวซ์ฟลาวินที่เกิดขึ้นจากการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์
รีดักเทส เพื่อที่จะส่งถ่ายให้กับเอนไซม์ออกซีจีเนสนั้น
เป็นสารที่ไม่ค่อยเสถียร โดยสามารถทำปฏิกิริยากับออกซิเจน
และ ได้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นสารผลิตภัณฑ์
ซึ่งเป็นอันตรายต่อเซลล์ ซึ่งการส่งผ่านของรีดิวซ์ฟลาวินระหว่างเอนไซม์สองตัวนี้
อาจจะเป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว หรือการจับกันระหว่างเอนไซม์
ซึ่งจะต้องเร็วกว่าการทำปฏิกิริยาของรีดิวซ์ฟลาวิน
กับออกซิเจน ดังนั้นการศึกษานี้จึงมีความสำคัญ
เพื่อที่จะทำให้เราเข้าใจถึงกลไกการควบคุมการส่งผ่านของสารที่ไม่เสถียรภายในเซลล์
ซึ่งถ้าระบบนี้ผิดปกติไปอาจเป็นอันตรายต่อเซลล์ได้
จากการศึกษาคุณสมบัติทางด้านอุณหพลศาสตร์
(thermodynamics) และจลนพลศาสตร์ (kinetics)
ของปฏิกิริยาการรับ อิเล็กตรอนของเอนไซม์
C1 จาก NADH พบว่ามีเอนไซม์ C1 อยู่ใน
2 รูปแบบ คือ แบบที่ทำปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนได้เร็ว
และช้า แต่ในกรณีที่มี HPA (ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของเอนไซม์
C2) จับกับเอนไซม์ C1 พบว่ามีผลต่ออัตราการรับอิเล็กตรอนจาก
NADH ได้เร็วถึง 30 เท่าเมื่อเทียบกับปฏิกิริยาที่ไม่มี
HPA (Biochemistry 44, 10434-42)
การเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์
C2 ต้องอาศัยสารตั้งต้นได้แก่ FMNH-,
HPA และออกซิเจน โดยเอนไซม์ C2 จะจับกับ
FMNH- เป็นตัวแรก ก่อนที่จะเกิดปฏิกิริยาขั้นตอนอื่นๆตามมา
ซึ่งการจับกันระหว่างเอนไซม์ C2 และ
FMNH- รวดเร็วและแน่นมากจึง ทำให้การส่งผ่านรีดิวซ์ฟลาวินจากเอนไซม์
C1 มายัง C2 เป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว
โดยที่ไม่เกิดปฏิกิริยาระหว่างรีดิวซ์ฟลาวิน
กับออกซิเจน เมื่อ C2: FMNH- ทำปฏิกิริยากับออกซิเจนจะเกิดสารตัวกลาง
C(4a)-hydroperoxyflavin ซึ่งสารนี้จะทำหน้าที่
เติมหมู่ไฮดรอกซีให้กับ HPA (J. Biol
Chem. 281(25), 17044-53)
ปัจจุบันได้มีข้อมูลทางโครงสร้างสามมิติจากการตกผลึกของเอนไซม์
C2 ในรูปแบบ 3 ลักษณะ คือ เอนไซม์ C2
(apoenzyme), C2 จับกับ FMNH- (C2:
FMNH-) และ C2 จับกับ FMNH-และ HPA
(C2: FMNH-: HPA) จากการศึกษาพบว่า
โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ C2 มีลักษณะคล้ายกับเอนไซม์ในกลุ่ม
acyl CoA dehydrogenase เมื่อเปรียบเทียบโครงสร้างสามมิติทั้ง
3 รูปแบบ ของเอนไซม์ C2 พบว่าโครงสร้างหลักไม่มีความแตกต่างกันเลย
แต่เมื่อเปรียบเทียบระหว่าง C2: FMNH-
และ C2: FMNH-: HPA พบว่าเมื่อมี HPA
เข้ามาจับกับ C2: FMNH- ทำให้หมู่แขนงของกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีนที่ตำแหน่ง
266 มีการหมุนตัวเพื่อให้ HPA เข้ามาจับในบริเวณเร่งปฏิกิริยา
(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104,
1177-1182)
Figure of the overall
structure of C2 ((Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 104, 1177-1182)
Structure of the complex
of C2:FMNH-
Structure of the complex
of C2:FMNH-:HPA
จากการศึกษาการทำงานร่วมกันระหว่างเอนไซม์
C1 และ C2 (Biochemistry 46, 8611-8623)
พบว่า หลังจากที่ FMN ถูกรีดิวซ์ด้วย
NADH ซึ่งได้ FMNH- และจะถูกส่งผ่านจากเอนไซม์
C1ไปยัง C2 จากการศึกษาโดยใช้เอนไซม์
cytochrome c เป็นตัวแย่งรับ FMNH-
จาก C1: FMNH- พบว่าถึงแม้จะมีปริมาณเอนไซม์
C2 อยู่ในปฏิกิริยาที่มากเกินพอ cytochrome
c ก็ยังสามารถแย่งจับกับ FMNH- ได้
ดังนั้นจึงสรุปได้ว่าการส่งผ่าน FMNH-
จากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 เป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว
ซึ่งไม่ต้องอาศัยการจับกันระหว่างเอนไซม์
C1 และ C2 ภายหลังจากสิ้นสุดการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์
C2 แล้ว FMN จะถูกส่งกับมายังเอนไซม์
C1 นอกจากนี้ยังพบว่า HPA ซึ่งเป็นตัวช่วยเร่งในปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนของเอนไซม์
C1 แล้วยังสามารถเร่งปฏิกิริยาการส่งผ่าน
FMNH- จากเอนไซม์ C1 ไปยัง C2 โดยการเพิ่มอัตราการส่งผ่านจาก
35 ต่อวินาที (ไม่มี HPA) เป็น 74 ต่อวินาที
ดังนั้นจึงสรุปได้ว่า HPA เป็นตัวควบคุมให้เกิดการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์
C1 ให้เร็วขึ้น
หัวข้องานวิจัยปัจจุบันของเอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส
1. การส่งผ่านรีดิวซ์ฟลาวิน
(FMNH-) จากเอนไซม์รีดักเทส (C1) ไปยัง
เอนไซม์ออกซีจีเนส (C2)
จากที่กล่าวมาข้างต้น กลไกการส่งผ่าน
FMNH- จากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 เป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว
ซึ่งไม่ต้องอาศัยการจับ กันระหว่างเอนไซม์
C1 และ C2 ดังนั้นอัตราการส่งผ่าน FMNH-
ระหว่างเอนไซม์จะต้องเร็วกว่าอัตราการเกิดปฏิกิริยาระหว่าง
FMNH- กับออกซิเจน ซึ่งได้สารผลิตภัณฑ์เป็นไฮโดรเจเปอร์ออกไซด์ที่เป็นอันตรายต่อเซลล์
จากการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่า HPA ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของเอนไซม์
C2 มีบทบาทที่สำคัญในการควบคุมการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์
C1 โดยการเพิ่มอัตราการรับอิเล็กตรอนของ
FMN จาก NADH ได้เร็วขึ้น 30 เท่า เมื่อเทียบกับปฏิกิริยาที่ไม่มี
HPA นอกจากนี้ HPA ยังสามารถเร่งปฏิกิริยาการส่งถ่าย
FMNH- จากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 อีกด้วย
ดังนั้นการศึกษาโครงสร้างสามมิติด้วยการตกผลึก
และการศึกษาจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ C1
ที่มีการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้อง
ในการจับกับ HPA จึงมีความสำคัญเพื่อที่จะทำให้เราเข้าใจโครงสร้าง
และการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ C1 ได้ดีขึ้น
2. ปฏิกิริยาของเอนไซม์ออกซีจีเนส
(C2) รีดิวซ์ฟลาวิน (FMNH-) และออกซิเจน
สิ่งที่น่าสนใจในศึกษาการทำงานของเอนไซม์
ในกลุ่มโมโนออกซีจีเนสที่ใช้ฟลาวินเป็นโคแฟกเตอร์
คือ การทำปฏิกิริยาของ เอนไซม์กับออกซิเจน
โดยจะได้สารตัวกลาง C(4a)-hydroperoxyflavin
ที่เสถียร ซึ่งสารตัวกลางนี้จะทำหน้าที่ในการเติม
หมู่ไฮดรอกซีให้กับสารตั้งต้น ในขณะที่กลุ่มของเอนไซม์ออกซิเดสที่มีฟลาวินเป็นโคแฟกเตอร์นั้น
เมื่อทำปฏิกิริยากับออกซิเจน จะนำมาซึ่งสารผลิตภัณฑ์คือ
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ซึ่งการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่า
ไม่สามารถตรวจพบสารตัวกลาง C(4a)-hydroperoxyflavin
ได้ ปัจจุบันได้มีข้อมูลทางจลนพลศาสตร์
(J. Biol Chem. 281(25), 17044-53)
และข้อมูลทางด้าน โครงสร้างสามมิติจากการตกผลึกของเอนไซม์
C2 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
104, 1177-1182) ดังนั้นเอนไซม์ C2
จึงน่าจะเป็นโมเดลต้นแบบในการศึกษาการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม
์ในกลุ่มโมโนออกซีจีเนส ที่เป็น Two
component enzyme ที่มีฟลาวินเป็นโคแฟกเตอร์
ในการศึกษาเพื่อที่จะทำความเข้าใจทางด้านโครงสร้าง
และการทำงานของเอนไซม์ C2 โดยการเปลี่ยนหมู่กรดอะมิโนที่คาดว่าน่าจะทำให้สารตัวกลาง
C(4a)-hydroperoxyflavin เสถียรไปเป็นกรดอะมิโนต่างชนิด
แล้วศึกษาคุณสมบัติทางจลนพลศาสตร์ ในการเร่งปฎิกิริยาด้วยเครื่อง
stopped-flow spectrophotometer ทั้งแบบ
single mixing และ double mixing
3. ปฏิกิริยาของเอนไซม์ออกซีจีเนส
(C2) ที่ pH ต่างๆ
การศึกษาการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์
C2 ที่ pH ต่างๆ ด้วยเครื่อง stopped-flow
spectrophotometer และ rapid quench
จะทำให้เราสามารถทราบถึงสถานะของสารตัวกลางต่างๆในแต่ละขั้นตอน
ในการเร่งปฏิกิริยาว่าน่าจะอยู่ในรูปแบบใด
นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงหมู่กรดอะมิโนในบริเวณเร่ง
ที่น่าจะเกี่ยวข้องกับขั้นตอนการเติมหมู่ไฮดรอกซีให้กับสารตั้งต้น
ไปเป็นกรดอะมิโนต่างชนิด จะเป็นข้อมูลที่สำคัญที่ทำให้เราเข้าใจทั้งโครงสร้างและการทำงานของเอนไซม์ในกลุ่มนี้ได้ดียิ่งขึ้น
ติดต่อเรา:
ห้องปฏิบัติการ (LAB) PR305 ตึก PR
ชั้น 3
ภาควิชาชีวเคมี
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล
ถนนพระรามที่ 6 กรุงเทพฯ 10400
โทร. 02-201-5596
หน่วยวิจัยโครงสร้างและการทำงานของโปรตีน
(CPSF)
อาคารเฉลิมพระเกียรติ ชั้น 4 ห้อง K419
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล
272 ถนนพระรามที่ 6 กรุงเทพฯ 10400
โทร: 02-201-5847 โทรสาร : 02-201-5843
e-mail : pimchai.cha@mahidol.ac.th
|