Faculty of Science, Mahidol University
ศ.ดร. พิมพ์ใจ ใจเย็น : Official Website
ภาษาไทย | English หน้าหลักคณะวิทยาศาสตร์ » ภาควิชาชีวเคมี » ศ.ดร. พิมพ์ใจ
   
แนะนำห้องปฏิบัติการ
เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิล
อะซีเตทไฮดรอกซีเลส
เอนไซม์ไพราโนสออกซิเดส
เอนไซม์ลูซิเฟอเรส
เอนไซม์เซอรีนไฮดรอกซี
เมธิลทรานสเฟอเรส
เทคนิคและวิธีการ
 
ประวัติและผลงาน (CV)
ประวัติในวิกิพีเดีย
รางวัลนักวิทย์รุ่นใหม่
 
กิจกรรมในต่างประเทศ
นักศึกษาและทีมวิจัย
ภาพกิจกรรมใน Lab
วิทยานิพนธ์ของนักศึกษา

เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส

การศึกษาเอนไซม์ในกลุ่มที่มีฟลาวินเป็นองค์ประกอบ

โครงสร้างของ FMN

เอนไซม์ในกลุ่มนี้ใช้อนุพันธ์ของวิตามินบีสอง ซึ่งอยู่ในรูปของฟลาวินอะดีนีนไดนิวคลีโอไทล์ (flavin adenine dinucleotide; FAD) และฟลาวินโมโนนิวคลีโอไทล์ (flavin mononucleotide; FMN) เป็นโคแฟกเตอร์ (ตัวช่วยในการทำปฏิกิริยา) เอนไซม์ กลุ่มนี้มีบทบาทที่สำคัญในการเร่งปฏิกิริยาการให้และรับอิเล็กตรอน ในปฏิกิริยาเคมีของสิ่งมีชีวิต

เราได้คัดเลือกเอนไซม์กลุ่มนี้ มาศึกษากลไกการทำงาน 3 ตัว คือ เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส (p-Hydroxyphenylacetate hydroxylase; HPAH) เอนไซม์ไพราโนสออกซิเดส (Pyranose oxidase) และ เอนไซม์ลูซิเฟอเรส (Bacterial luciferase)


เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส จากเชื้อแบคทีเรีย Acinetobacter baumannii

           เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส (p-Hydroxyphenylacetate hydroxylase; HPAH) เป็นเอนไซม์ ในกลุ่มฟลาโวโปรตีนโมโนออกซีจีเนส (Flavoprotein monooxygenase) โดยถูกคัดแยกมาจากจากเชื้อแบคทีเรีย Acinetobacter baumannii เอนไซม์นี้ทำหน้าที่เติมหมู่ไฮดรอกซีให้กับสารตั้งต้น นำมาซึ่งสารผลิตภัณฑ์ที่สลายตัวได้ง่ายขึ้น หรือสารที่ละลาย น้ำได้ดีขื้น และจะเป็นประโยชน์อย่างมากในการย่อยสลายสารเคมีตกค้าง ที่เป็นพิษต่อสิ่งแวดล้อม จากการศึกษาพบว่าเอนไซม์นี้ ประกอบด้วยเอนไซม์สองส่วนที่ไม่ได้ยึดติดกัน ส่วนแรกคือ เอนไซม์รีดักเทส (Reductase component; C1) ที่ใช้ FMN เป็นโคแฟกเตอร์ ซึ่งทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนจาก Nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form; NADH) เพื่อผลิตรีดิวซ์ฟลาวิน (FMNH-) ให้กับส่วนที่สอง คือ เอนไซม์ออกซีจีเนส (Oxygenase component; C2) โดยจะทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาเติมหมู่ไฮดรอกซี (Hydroxylation หรือ Monooxygenation) ให้กับสารตั้งต้น คือ พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตท (p-hydroxyphenylacetate; HPA) (Eur J. Biochem 268, 5550-61) ในปฏิกิริยาที่ไม่มีเอนไซม์ C2 เอนไซม์ C1 สามารถเร่งปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนจาก NADH ได้สารผลิตภัณฑ์เป็นไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ในปัจจุบัน เราได้ทำการโคลนและแสดงออกของยีน โดยใช้แบคทีเรีย E. coli เพื่อให้ได้เอนไซม์ในปริมาณที่มากพอสำหรับศึกษาวิจัย (Biochim Biophys Acta 1680 (1), 60-6)
            
          ในระยะ 10 ปีที่ผ่านมา ได้มีรายงานการวิจัยเกี่ยวกับเอนไซม์โมโนออกซีจีเนส ที่ประกอบด้วยเอนไซม์สองส่วนที่คล้ายๆ กับเอนไซม์ C1 และ C2 ซึ่งเอนไซม์กลุ่มนี้จะเกี่ยวข้องกับการย่อยสลายสารเคมีสังเคราะห ์หรือสารพิษที่ตกค้างอยู่ในธรรมชาติ อีกทั้งยังเกี่ยวข้องกับกระบวนการสร้างสารยับยั้งจุลินทรีย์อีกด้วย เนื่องจากรีดิวซ์ฟลาวินที่เกิดขึ้นจากการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ รีดักเทส เพื่อที่จะส่งถ่ายให้กับเอนไซม์ออกซีจีเนสนั้น เป็นสารที่ไม่ค่อยเสถียร โดยสามารถทำปฏิกิริยากับออกซิเจน และ ได้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นสารผลิตภัณฑ์ ซึ่งเป็นอันตรายต่อเซลล์ ซึ่งการส่งผ่านของรีดิวซ์ฟลาวินระหว่างเอนไซม์สองตัวนี้ อาจจะเป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว หรือการจับกันระหว่างเอนไซม์ ซึ่งจะต้องเร็วกว่าการทำปฏิกิริยาของรีดิวซ์ฟลาวิน กับออกซิเจน ดังนั้นการศึกษานี้จึงมีความสำคัญ เพื่อที่จะทำให้เราเข้าใจถึงกลไกการควบคุมการส่งผ่านของสารที่ไม่เสถียรภายในเซลล์ ซึ่งถ้าระบบนี้ผิดปกติไปอาจเป็นอันตรายต่อเซลล์ได้

          จากการศึกษาคุณสมบัติทางด้านอุณหพลศาสตร์ (thermodynamics) และจลนพลศาสตร์ (kinetics) ของปฏิกิริยาการรับ อิเล็กตรอนของเอนไซม์ C1 จาก NADH พบว่ามีเอนไซม์ C1 อยู่ใน 2 รูปแบบ คือ แบบที่ทำปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนได้เร็ว และช้า แต่ในกรณีที่มี HPA (ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของเอนไซม์ C2) จับกับเอนไซม์ C1 พบว่ามีผลต่ออัตราการรับอิเล็กตรอนจาก NADH ได้เร็วถึง 30 เท่าเมื่อเทียบกับปฏิกิริยาที่ไม่มี HPA (Biochemistry 44, 10434-42)

          การเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ C2 ต้องอาศัยสารตั้งต้นได้แก่ FMNH-, HPA และออกซิเจน โดยเอนไซม์ C2 จะจับกับ FMNH- เป็นตัวแรก ก่อนที่จะเกิดปฏิกิริยาขั้นตอนอื่นๆตามมา ซึ่งการจับกันระหว่างเอนไซม์ C2 และ FMNH- รวดเร็วและแน่นมากจึง ทำให้การส่งผ่านรีดิวซ์ฟลาวินจากเอนไซม์ C1 มายัง C2 เป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว โดยที่ไม่เกิดปฏิกิริยาระหว่างรีดิวซ์ฟลาวิน กับออกซิเจน เมื่อ C2: FMNH- ทำปฏิกิริยากับออกซิเจนจะเกิดสารตัวกลาง C(4a)-hydroperoxyflavin ซึ่งสารนี้จะทำหน้าที่ เติมหมู่ไฮดรอกซีให้กับ HPA (J. Biol Chem. 281(25), 17044-53)

          ปัจจุบันได้มีข้อมูลทางโครงสร้างสามมิติจากการตกผลึกของเอนไซม์ C2 ในรูปแบบ 3 ลักษณะ คือ เอนไซม์ C2 (apoenzyme), C2 จับกับ FMNH- (C2: FMNH-) และ C2 จับกับ FMNH-และ HPA (C2: FMNH-: HPA) จากการศึกษาพบว่า โครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ C2 มีลักษณะคล้ายกับเอนไซม์ในกลุ่ม acyl CoA dehydrogenase เมื่อเปรียบเทียบโครงสร้างสามมิติทั้ง 3 รูปแบบ ของเอนไซม์ C2 พบว่าโครงสร้างหลักไม่มีความแตกต่างกันเลย แต่เมื่อเปรียบเทียบระหว่าง C2: FMNH- และ C2: FMNH-: HPA พบว่าเมื่อมี HPA เข้ามาจับกับ C2: FMNH- ทำให้หมู่แขนงของกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีนที่ตำแหน่ง 266 มีการหมุนตัวเพื่อให้ HPA เข้ามาจับในบริเวณเร่งปฏิกิริยา (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1177-1182)

Figure of the overall structure of C2 ((Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1177-1182)

Structure of the complex of C2:FMNH-

Structure of the complex of C2:FMNH-:HPA

          จากการศึกษาการทำงานร่วมกันระหว่างเอนไซม์ C1 และ C2 (Biochemistry 46, 8611-8623) พบว่า หลังจากที่ FMN ถูกรีดิวซ์ด้วย NADH ซึ่งได้ FMNH- และจะถูกส่งผ่านจากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 จากการศึกษาโดยใช้เอนไซม์ cytochrome c เป็นตัวแย่งรับ FMNH- จาก C1: FMNH- พบว่าถึงแม้จะมีปริมาณเอนไซม์ C2 อยู่ในปฏิกิริยาที่มากเกินพอ cytochrome c ก็ยังสามารถแย่งจับกับ FMNH- ได้ ดังนั้นจึงสรุปได้ว่าการส่งผ่าน FMNH- จากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 เป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว ซึ่งไม่ต้องอาศัยการจับกันระหว่างเอนไซม์ C1 และ C2 ภายหลังจากสิ้นสุดการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ C2 แล้ว FMN จะถูกส่งกับมายังเอนไซม์ C1 นอกจากนี้ยังพบว่า HPA ซึ่งเป็นตัวช่วยเร่งในปฏิกิริยาการรับอิเล็กตรอนของเอนไซม์ C1 แล้วยังสามารถเร่งปฏิกิริยาการส่งผ่าน FMNH- จากเอนไซม์ C1 ไปยัง C2 โดยการเพิ่มอัตราการส่งผ่านจาก 35 ต่อวินาที (ไม่มี HPA) เป็น 74 ต่อวินาที ดังนั้นจึงสรุปได้ว่า HPA เป็นตัวควบคุมให้เกิดการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ C1 ให้เร็วขึ้น

หัวข้องานวิจัยปัจจุบันของเอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส

1. การส่งผ่านรีดิวซ์ฟลาวิน (FMNH-) จากเอนไซม์รีดักเทส (C1) ไปยัง เอนไซม์ออกซีจีเนส (C2)
จากที่กล่าวมาข้างต้น กลไกการส่งผ่าน FMNH- จากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 เป็นแบบการแพร่อย่างรวดเร็ว ซึ่งไม่ต้องอาศัยการจับ กันระหว่างเอนไซม์ C1 และ C2 ดังนั้นอัตราการส่งผ่าน FMNH- ระหว่างเอนไซม์จะต้องเร็วกว่าอัตราการเกิดปฏิกิริยาระหว่าง FMNH- กับออกซิเจน ซึ่งได้สารผลิตภัณฑ์เป็นไฮโดรเจเปอร์ออกไซด์ที่เป็นอันตรายต่อเซลล์ จากการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่า HPA ซึ่งเป็นสารตั้งต้นของเอนไซม์ C2 มีบทบาทที่สำคัญในการควบคุมการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ C1 โดยการเพิ่มอัตราการรับอิเล็กตรอนของ FMN จาก NADH ได้เร็วขึ้น 30 เท่า เมื่อเทียบกับปฏิกิริยาที่ไม่มี HPA นอกจากนี้ HPA ยังสามารถเร่งปฏิกิริยาการส่งถ่าย FMNH- จากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 อีกด้วย ดังนั้นการศึกษาโครงสร้างสามมิติด้วยการตกผลึก และการศึกษาจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ C1 ที่มีการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้อง ในการจับกับ HPA จึงมีความสำคัญเพื่อที่จะทำให้เราเข้าใจโครงสร้าง และการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ C1 ได้ดีขึ้น

2. ปฏิกิริยาของเอนไซม์ออกซีจีเนส (C2) รีดิวซ์ฟลาวิน (FMNH-) และออกซิเจน
สิ่งที่น่าสนใจในศึกษาการทำงานของเอนไซม์ ในกลุ่มโมโนออกซีจีเนสที่ใช้ฟลาวินเป็นโคแฟกเตอร์ คือ การทำปฏิกิริยาของ เอนไซม์กับออกซิเจน โดยจะได้สารตัวกลาง C(4a)-hydroperoxyflavin ที่เสถียร ซึ่งสารตัวกลางนี้จะทำหน้าที่ในการเติม หมู่ไฮดรอกซีให้กับสารตั้งต้น ในขณะที่กลุ่มของเอนไซม์ออกซิเดสที่มีฟลาวินเป็นโคแฟกเตอร์นั้น เมื่อทำปฏิกิริยากับออกซิเจน จะนำมาซึ่งสารผลิตภัณฑ์คือ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ซึ่งการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่า ไม่สามารถตรวจพบสารตัวกลาง C(4a)-hydroperoxyflavin ได้ ปัจจุบันได้มีข้อมูลทางจลนพลศาสตร์ (J. Biol Chem. 281(25), 17044-53) และข้อมูลทางด้าน โครงสร้างสามมิติจากการตกผลึกของเอนไซม์ C2 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1177-1182) ดังนั้นเอนไซม์ C2 จึงน่าจะเป็นโมเดลต้นแบบในการศึกษาการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม ์ในกลุ่มโมโนออกซีจีเนส ที่เป็น Two component enzyme ที่มีฟลาวินเป็นโคแฟกเตอร์ ในการศึกษาเพื่อที่จะทำความเข้าใจทางด้านโครงสร้าง และการทำงานของเอนไซม์ C2 โดยการเปลี่ยนหมู่กรดอะมิโนที่คาดว่าน่าจะทำให้สารตัวกลาง C(4a)-hydroperoxyflavin เสถียรไปเป็นกรดอะมิโนต่างชนิด แล้วศึกษาคุณสมบัติทางจลนพลศาสตร์ ในการเร่งปฎิกิริยาด้วยเครื่อง stopped-flow spectrophotometer ทั้งแบบ single mixing และ double mixing

3. ปฏิกิริยาของเอนไซม์ออกซีจีเนส (C2) ที่ pH ต่างๆ
การศึกษาการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ C2 ที่ pH ต่างๆ ด้วยเครื่อง stopped-flow spectrophotometer และ rapid quench จะทำให้เราสามารถทราบถึงสถานะของสารตัวกลางต่างๆในแต่ละขั้นตอน ในการเร่งปฏิกิริยาว่าน่าจะอยู่ในรูปแบบใด นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงหมู่กรดอะมิโนในบริเวณเร่ง ที่น่าจะเกี่ยวข้องกับขั้นตอนการเติมหมู่ไฮดรอกซีให้กับสารตั้งต้น ไปเป็นกรดอะมิโนต่างชนิด จะเป็นข้อมูลที่สำคัญที่ทำให้เราเข้าใจทั้งโครงสร้างและการทำงานของเอนไซม์ในกลุ่มนี้ได้ดียิ่งขึ้น

 

ติดต่อเรา:
ห้องปฏิบัติการ (LAB) PR305 ตึก PR ชั้น 3
ภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล
ถนนพระรามที่ 6 กรุงเทพฯ 10400
โทร. 02-201-5596

หน่วยวิจัยโครงสร้างและการทำงานของโปรตีน (CPSF)
อาคารเฉลิมพระเกียรติ ชั้น 4 ห้อง K419
คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล
272 ถนนพระรามที่ 6 กรุงเทพฯ 10400
โทร: 02-201-5847 โทรสาร : 02-201-5843 e-mail : pimchai.cha@mahidol.ac.th

 

[ มหาวิทยาลัยมหิดล ][ คณะวิทยาศาสตร์ ] พิมพ์ใจ ใจเย็น

http://science.mahidol.ac.th - ปรับปรุงครั้งล่าสุด : 15 กุมภาพันธ์ 2561
สงวนลิขสิทธิ์ พ.ศ. 2561 คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล

best tracker |